При самолечении и самостоятельной сдаче анализов для исследования методом ПЦР в сетевой лаборатории высок риск того, что вы будете годами лечиться от несуществующей болезни.
Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
Этапы проведения ПЦР исследования Забор биологического материала для исследования В качестве пробы служит различный биологический материал: кровь и ее компоненты, моча, слюна, отделяемое слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, отделяемое раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Все биопробы собираются одноразовыми инструментами, а набранный материал заключают в пластиковые стерильные пробирки или помещают на культуральные среды, с последующей транспортировкой в лабораторию. В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат — термоциклер амплификатор. В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов денатурация, отжиг и удлинение. Что это означает? Рассмотрим подробнее. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра. II этап — Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки». Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. III этап - Копирование генетического материала возбудителя инфекции.
К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК.
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях in vitro. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Кроме простого увеличения числа копий ДНК этот процесс называется амплификацией , ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК , и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний наследственных, инфекционных , для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов. Специфичность и применение ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.
ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем ИППП. Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций , таких как гепатиты , ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими это сделать невозможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды вода, почва и т. В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза , гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях in vitro. Метод ПЦР имеет очень высокую информативность и позволяет легко и эффективно определять наличие микобактерии в организме, но, только если проводить анализ мокроты если это туберкулез органов дыхания или мочи при туберкулезе орагнов мочевыделительной системы , а не крови.
ПЦР анализ крови на туберкулез нельзя считать информативным, так как ДНК микобактерии туберкулеза в крови бывает только у больных туберкулезным сепсисом, что на практике встречается весьма редко. Полимеразная цепная реакция ПЦР позволяет всего в течение нескольких часов обнаружить возбудителя инфекции, причем выявить можно даже 1-2 молекулы среди огромного количества.
Доставьте контейнер в лабораторное отделение в течение 2 часов после сбора. Чтобы сохранить температуру контейнера, можно поместить его в термос с кубиком льда или в пакет с хладоэлементами. Если отслеживаете показатели в динамике, сдавайте каждый анализ при одинаковых условиях: в том же лабораторном отделении, тем же методом. Исследования для оценки эффективности лечения, как правило, проводят через 2—4 недели после приёма антибактериальных препаратов. Подготовка к ПЦР-анализу слюны За 24 часа до исследования по предварительному согласованию с лечащим врачом следует отказаться от терапии полости рта какими-либо лекарственными препаратами. За 3 часа до исследования рекомендуется отказаться от курения, употребления пищи и гигиены полости рта полоскание, чистка зубов, применение освежителей для рта, употребление леденцов, жевательной резинки. Подготовка к ПЦР-анализу мокроты За 2 недели до исследования по согласованию с лечащим врачом следует прекратить приём противомикробных препаратов и иммуномодуляторов. Мокроту следует собирать утром, сразу после пробуждения.
Предварительно нужно почистить зубы и прополоскать рот, нельзя есть до взятия биоматериала. Важно собирать не слюну или носоглоточную слизь, а мокроту. Сделайте несколько глубоких вдохов, чтобы вызвать «мокрый» кашель. Необходимо откашлять содержимое глубоких дыхательных путей. Сплюньте мокроту в заранее подготовленный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой.
Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
ПЦР тест также можно использовать для прямой диагностики наличия заболевания и мутаций в развивающемся эмбрионе. Например, впервые ПЦР была использована таким образом для диагностики серповидно-клеточной анемии путем обнаружения мутации одного гена. Как проводится ПЦР-анализ Метод полимеразно-цепной реакции постоянно развивается. Самым распространенным на сегодня является тест в реальном времени, с помощью которого можно определить исходное количество копий ДНК РНК. ПЦР с вложенной парой праймеров гнездовая проводится в две стадии для снижения вероятности амплификации неспецифичных участков ДНК. Инвертированная ПЦР используется в случае, когда нужно выяснить природу неизвестных участков ДНК, окружающих известный.
Это только часть методов ПЦР, количество которых постоянно пополняется новыми технологичными вариантами. Для проведения анализа биоматериала с помощью ПЦР необходимо обеспечить его правильное взятие. При взятии мазка из носоглотки или ротоглотки образец биоматериала собирают путем введения длинного зонда-тампона в ноздрю или в заднюю часть горла. Во время анализа крови медицинский работник возьмет образец из вены на руке с помощью небольшой иглы. Количественный ПЦР в реальном времени позволяет также оценить инфекционную нагрузку, а также определить момент, когда условно-патогенные микроорганизмы стали патогенными в результате неконтролируемого роста.
Список источников Mousa G.
Гордиев М. Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога. Секвенирование по Сэнгеру С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера - низкая чувствительность.
Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов как следствие - пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным. Учитывая развитие и доступность в России в том числе по ОМС в МИБС более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии. При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика? Данное оборудование, точнее, технологический цикл секвенирования с использованием оборудования Illumina, обеспечивает высокую скорость расшифровки секвенирования ДНК и относительно низкую стоимость исследования, позволяющую использовать этот современный диагностический метод в широкой клинической практике. Интерпретация полученных данных проводится в соответствии с постоянно дополняемыми международными информационными базами мутаций.
В нашей лаборатории работают уникальные специалисты, имеющие профессиональную подготовку и богатый подтвержденный опыт как клинической, так и научной работы в направлении секвенирования генома. Вовлеченность в международное профессиональное сообщество и постоянное взаимодействие с клиническими онкологами и химиотерапевтами лечебных центров МИБС позволяет оперативно реагировать на потребности отрасли. Именно поэтому услуги молекулярно-генетической лаборатории МИБС востребованы онкологами по всей РФ - с конца 2021 года образцы для выполнения исследования можно передать в любом из региональных центров МИБС либо отправить курьерской службой для получения подробной информации о логистике образцов, обратитесь любым из доступных на сайте способов. К тому же большинство исследований, связанных с определением эффективности лечения, могут быть выполнены в нашей лаборатории за счет ОМС , независимо от региона проживания гражданина РФ. Комплексное геномное профилирование КГП определяет уникальный молекулярный профиль опухоли, изучая список из 324 генов, значимых с точки зрения лечения онкологических заболеваний.
Если в результате исследования антигены коронавируса не обнаружены, это означает, что на момент проведения теста пациент не инфицирован. Однако чувствительность экспресс-теста несколько ниже, чем у метода ПЦР. Так же, как и в случае с ПЦР-тестом, отрицательные результаты у людей с симптомами COVID-19 возможны при низкой вирусной нагрузке, поздних стадиях заболевания и неправильном взятии биоматериала. Современные экспресс-тесты информативны для диагностики COVID-19 вне зависимости от штамма коронавируса, отметили в Роспотребнадзоре.
Сейчас ПЦР-диагностику освоили во многих крупных лабораториях и продвигают её в качестве коммерческого метода, доступного каждому, кто хочет обследоваться. Обычно предлагают готовые наборы анализов: ПЦР на 3-5-7-14-16 и другое количество инфекций, передающихся половым путем. Нередко анализ навязывают тогда, когда обследоваться совсем не обязательно или можно обойтись более дешевой диагностикой без потери качества. Давайте разберемся, когда нужно искать половые инфекции и когда это необходимо делать именно методом ПЦР. Обследоваться на ЗППП можно хоть каждый день — по желанию. Все зависит от наличия свободного времени, денег и уровня вашей тревожности. Есть только один нюанс. Метод ПЦР — очень точный анализ.
С его помощью можно обнаружить в недрах организма считанные копии вируса или бактерии. И ни один честный врач не скажет вам наверняка, насколько эта находка опасна для здоровья, и каков достоверный риск осложнений. Поэтому решите для себя заранее, сможете ли вы спокойно жить дальше или будете лечить результаты анализа даже в тех случаях, когда до похода в клинику у вас не было никаких проблем с интимным здоровьем. Иначе обстоят дела с обследованием на ЗППП в группе риска — у людей с рискованным сексуальным поведением и беременных женщин. Им необходимо периодически сдавать анализы на половые инфекции, даже если нет никаких жалоб на здоровье. Сексуальным экстремалам профилактическое обследование нужно, чтобы выявить факт инфицирования еще до появления симптомов и как можно раньше принять меры для защиты своих половых партнеров от заражения. Беременным женщинам диагностика ЗППП необходима, потому что многие мамины инфекции передаются будущему малышу. Даже если нет симптомов у женщины, последствия для ребенка могут быть тяжелыми.
Согласно принятым государственным программам как в нашей стране , так и в США , профилактическая диагностика скрининг на ЗППП проводится только среди людей с рискованным сексуальным поведением и у беременных женщин. Скрининг на герпес и ВПЧ не проводят даже в группе риска. Для остальных людей при отсутствии жалоб и клинических проявлений обследование на ЗППП вообще не рекомендуется. Забор материала — дело нескольких минут. Врач делает это с помощью стерильного зонда в виде ватной палочки, щетки, «ершика» или специальной ложки.
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
Такие исследования не проводятся при контрольном тестировании после проведения лечения. Когда берется ПЦР анализ после лечения, при разных инфекциях, можно получить положительный результат, который будет ложным. Это связано с тем, что частички убитых возбудителей, уже неактивные, могут давать положительную реакцию. Если вы сомневаетесь, можно ли вам сдавать ПЦР или нет, проконсультируйтесь с врачом.
Разберем, какие материалы могут быть применены для тестирования ПЦР. Тем не менее, существует определенный перечень материалов, которые покажут наиболее точные результаты. Соскобы со слизистых оболочек чаще всего уретры, влагалища, шейки матки.
Их исследуют, главным образом, для диагностики половых инфекций. Таким способом во взятом мазке можно обнаружить возбудителей уреаплазменной и микоплазменной инфекций, гонококки, хламидии, трихомонады, гарднереллы, грибки рода Candida, вирус генитального герпеса и др. Ее можно использовать в диагностике урогенитальных инфекций.
ПЦР анализ мочи является альтернативой исследованию мазка из уретры для мужчин. Это особенно подходит тем пациентам, которые боятся болезненного взятия уретрального мазка.
Такое бывает, когда мазок берут со слизистой носовых ходов и ротовой полости, а не из носоглотки и ротоглотки. Эспресс-тесты проводятся для обнаружения антигенов коронавируса — белковых частиц, которые входят в состав вируса и распознаются иммунной системой. Экспресс-тесты на COVID-19 достаточно просты в использовании, а их проведение не требует специальной лаборатории и больших временных затрат результат бывает готов через 15-30 минут. Специальных навыков для проведения экспресс-тестирования также не требуется. По этой причине экспресс-тесты часто используются в учебных заведениях, на рабочих местах, в пунктах экспресс-тестирования в общественных местах, а также непосредственно на приёме врача.
Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе.
Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции. Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность. ПЦР-анализ — главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 COVID-19 , ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР. ПЦР-тесты применяются везде, где нужен быстрый, точный и надежный результат. Подготовка к проведению ПЦР-теста Еще одно немаловажное преимущество ПЦР-анализов — это отсутствие специфической подготовки к проведению тестов. Достаточно следовать стандартным рекомендациям специалиста: Анализ сдается утром натощак.
При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту. При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом. Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток. Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты. Подробную инструкцию по правилам подготовки к каждому анализу вы всегда можете получить у лечащего врача или у консультантов на нашей горячей линии. Как проводится ПЦР-анализ С 1983 года, когда был изобретен данный метод, прошло много времени, и технологии не стоят на месте.
Их забирают методом биопсии.
Преимущества и недостатки метода ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме». По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала: «Самый первый недостаток метода — необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать.
Второе — чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры — кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый — по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера.
Улучшение качества обследования пациентов с помощью ПЦР-лаборатории
Метод ПЦР позволяет выявить наличие определенной ДНК последовательности с мутацией и подтвердить диагноз. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания.
Микробиологические исследования
Анализ — полимеразная цепная реакция имеет аббревиатуру — ПЦР. Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека. Метод ПЦР позволяет выявить наличие определенной ДНК последовательности с мутацией и подтвердить диагноз. ПЦР анализ на инфекции Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии.
Улучшение качества обследования пациентов с помощью ПЦР-лаборатории
Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. В России начали внедрять в клиническую практику ПЦР-анализы на коронавирусную инфекцию по любым доступным пробам биологических жидкостей. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале. Анализ крови методом ПЦР. ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одним из высокоточных методов, с помощью которого осуществляют диагностику инфекций различного характера, а в его основе лежит изучение генетических образцов материала человека. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований.
Риск получения ошибочного результата
- Мутации врозь: ПЦР-тесты научились отличать «Омикрон» от «Дельты» | Статьи | Известия
- ПЦР или ИФА: что лучше, отрицательно, положительно, чем отличается
- Основные принципы
- Важность клинической диагностики ВИЧ
Что такое анализ ПЦР?
Клонирование происходит либо просто выращиванием клеток в чашке Петри, либо в случаях, когда это было бы слишком медленно или по каким-то причинам не получилось бы при помощи так называемой полимеразной цепной реакции. В кратком и неточном изложении работает она примерно так: сначала ДНК денатурируют, то есть разрушают водородные связи, получая отдельные нити. На следующем этапе полимераза копирует ДНК, после чего процесс можно повторять: после новой денатурации отдельных нитей будет уже вдвое больше, на третьем цикле — вчетверо, и так далее. Все эти эффекты достигаются в основном с помощью изменений температуры смеси из ДНК, праймеров и полимеразы; для наших целей важно, что это достаточно точный процесс, и ошибки в нём редки, а на выходе получается большое число копий участков одной и той же ДНК. Разные методы секвенирования отличаются друг от друга не методами клонирования, а тем, как потом прочесть получившийся «суп» из многочисленных копий одной и той же ДНК...
Примечание редактора Если имеется желание ознакомиться с темой секвенирования более детально, а не в обзорном порядке, то в данном разделе предусмотрен т. Выделение ДНК и РНК Выделение нуклеиновых кислот Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР, секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта. Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах.
Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. В данной статье рассматриваются самые распространенные, а также прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот. Итак, выделение ДНК и РНК - важный шаг подготовки проб для выполнения различных задач в микробиологии, биотехнологии, биохимии, медицинской диагностике и т. Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т.
На сегодняшний день имеется множество специализированных методик, которые могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот с высокой степенью очистки. Наиболее известные из них относятся к методикам осаждения НК на суспензионный носитель и выделения НК на колонках. Однако набирают популярность и другие методы, о которых будет сказано позднее. Видео: Выделение ДНК.
Просо о сложном. В зависимости от того, из какого организма выделяют НК используют различные методы разрушения клеток: Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий — ЭДТА, лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или гуанидинизотиоцианат. Разрушение клеток животных и человека не вызывает сложностей: используют гомогенизацию, обработку SDS додецилсульфатом натрия , либо клетки обрабатывают протеиназами.
Для разрушения клеточных стенок растений — ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. Отделение нуклеиновых кислот от белков Депротеинизацию клеточного лизата часто осуществляют с помощью фенола и хлороформа белки переходят в фазу растворителя. Молекулярщики часто подразумевают смесь водонасыщенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование.
Часто белки разрушают протеиназами, например, протеиназой К; центрифугированием для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Ряд современных методов предусматривает осаждение ДНК на гранулах силикагеля, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые коммерческие наборы предусматривают сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Когда нуклеиновые кислоты остаются в водном растворе: ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе.
Концентрацию полученной нуклеиновой кислоты, а также наличие примесей белки обычно определяют спектрофотометрически по поглощению на А260 нм. Максимум поглощения белка приходится на 280 нм. Для оценки чистоты препарата ДНК, свободного от РНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, то есть на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов, соответственно. Пять популярных методик выделения нуклеиновых кислот Выделение фенол-хлороформом Рис.
Схема протокола выделения фенол-хлороформным методом. Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот. Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической нижней фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной верхней фазе Рис.
Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.
Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени. Выделение на спин-колонках Рис. Схема протокола выделения на спин-колонках.
Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё Рис. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.
Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено. Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.
Выделение на магнитных частицах Рис. Схема протокола выделения на магнитных частицах. Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 3. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.
К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют Рис. Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование например, центрифуга.
Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца. Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие.
Умное выделение Smart Extraction Рис. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena. Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry.
Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества Рис. Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы.
Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот. Ферментативное температурно-зависимое выделение Рис. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM.
Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.
Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами. Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов.
Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения от 7 минут и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов. Разрезание и сшивание ДНК Рестрикция и рестриктазы Разрезание ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах.
Этот метод был изобретен при изучении в 1950—1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой. Оказалось, что они для этого используют ферменты, позднее названные рестрикционными нуклеазами или рестриктазами. Важным свойством каждого подобного фермента является его способность разрезать строго определенную - целевую - последовательность нуклеотидов ДНК. Рестриктазы не воздействуют на собственную ДНК клетки, поскольку нуклеотиды в целевых последовательностях модифицированы так что, рестриктаза не может с ними работать Правда, иногда, наоборот, они могут разрезать только модифицированные последовательности - для борьбы с теми, кто модифицирует ДНК, защищаясь от вышеописанных рестриктаз.
Из-за того, что целевые последовательности бывают различной длины, частота встречаемости их в молекулах ДНК варьирует чем: длиннее необходимый фрагмент, тем меньше вероятность его появления. Соответственно, образующиеся при обработке различными рестриктазами фрагменты ДНК будут иметь различную длину. Рисунок слева. Сайты рестрикции.
Сверху — целевая последовательность рестриктазы SmaI, при работе которой образуются «тупые» концы. Снизу — целевая последовательность рестриктазы EcoRI, при работе которой образуются «липкие» концы. Итак, рестриктазы — это группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических и некоторых других организмах и выполняющие тем самым «иммунную» функцию — системы рестрикции-модификации.
Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода - высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы — позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях. Применение ПЦР Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования , а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР: клиническая медицина.
Для ПЦР берутся следующие материалы: Мазок или эпителиальный соскоб со слизистых оболочек. Это может быть уретра, влагалище, шейка матки, цервикальный канал, задний проход, ротовая, носовая и даже глазная полость. Мазки наиболее актуальны при диагностике заболеваний, передающихся половым путём. Для взятия мазка или соскоба используются зонды с разными наконечниками; Кровь из вены берут, когда нужно обнаружить ВИЧ, гепатит, цитомегаловирус, мононуклеоз или какое-либо заболевание бактериальной этиологии, например, сифилис, холеру или боррелиоз; Биологические жидкости моча, слюна, сперма, мокрота, секрет предстательной железы, желудочный сок, плевральная, суставная, спинномозговая или амниотическая жидкость, а также бронхоальвеолярный лаваж берутся по показаниям. Например, ПЦР-анализ мокроты используется при диагностике туберкулёза; Пунктаты и биоптаты органов и тканей, как правило, берутся при подозрении на онкологию. Исключение составляет биопсия желудка, которую проводят для определения наличия Helicobacter pylori — бактерии, вызывающей гастрит и язвенную болезнь. Хранение и транспортировка биоматериалов Пробы подлежат отправке в амплификатор не позднее, чем через 2 часа после забора, если они находятся в помещении при комнатной температуре. После оттаивания они должны быть сразу использованы, повторное замораживание запрещено. В подавляющем большинстве случаев ПЦР-диагностика проводится «день в день»: пациент приходит в клинику, где у него берут мазок или кровь и сразу отправляют биоматериал в лабораторию, поэтому беспокоиться о правилах хранения не стоит. Как подготовиться к ПЦР-диагностике? Правила довольно просты: Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища спринцевания, свечи. Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию если таковая проводилась не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа; Кровь сдается из вены утром натощак; Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома. Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов — максимум 2 часа; Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой. Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз. Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки. Результаты ПЦР-анализа Выше мы упоминали о качественной и количественной ПЦР-диагностике, так вот, в первом случае расшифровка результатов не представляет никакой трудности: ответ либо положительный, либо отрицательный.
Этот метод позволяет выделить в исследуемом материале уникальный участок генетической информации любого организма. В настоящее время ПЦР широко применяется в следующих отраслях: в генетических исследованиях, диагностике инфекционных заболеваний, для определения ГМО в продуктах питания, в ветеринарии, растениеводстве и судебно-медицинской экспертизе, позволяя производить разнопрофильные исследования на минимальном оборудовании, с привлечением меньшего количества квалифицированного персонала по сравнению с другими методами. Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды. ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании при скрининговой детекции вирусных и бактериальных возбудителей ОКИ в лабораторной диагностике и санитарно-эпидемиологическом надзоре.
Суть метода
- А как обнаружить скрытые инфекции у мужчин и женщин?
- Что такое ПЦР?
- Актуальные методы диагностики COVID-19
- ПЦР-исследования
- Настройки шрифта:
- Цепная реакция. Как работают тесты на коронавирус?